Как выбрать микроскоп?

Как выбрать микроскоп? Для чего он нужен?

Если Вы столкнулись с подобного рода вопросами - то скорее всего Вы найдёте ответ в этой статье.

Попробуем составить небольшой перечень шагов - как же всё таки правильно выбрать микроскоп?

Оптический или световой микроскоп — оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом.

Шаг 1. Определиться с целью приобретения микроскопа

Необходимо четко представлять поставленные задачи, чтобы правильно выбрать необходимый микроскоп. Для упрощения этого процесса можете связаться с нами.

Можете ознакомиться с видеоматериалом представленным ниже.

На сегодняшний день микроскопы нашли применение во многих сферах жизнедеятельности человека - начиная простыми домашними микроскопами для изучения образцов и заканчивая электронными микроскопами с разрешением менее 0,05 нм - вчетверо меньше диаметра атома углерода. Поэтому стоить понимать - для каких целей и как Вы собираетесь использовать Ваш микроскоп. Чтобы внести ясность в этот вопрос - перечислим основные типы микроскопов и сферу их применения:

I. Оптические микроскопы

Оптические микроскопы являются наиболее распространенными микроскопами, которые используют свет, чтобы пройти через образец для генерации изображений. Они могут иметь очень простую конструкцию, хотя сложные оптические микроскопы направлены на повышение разрешения и контрастности образца. В дальнейшем их можно подразделить на два типа: простые и сложные микроскопы. Простой микроскоп использует одну линзу (например, увеличительное стекло) для увеличения, в то время как сложные микроскопы используют несколько линз для увеличения образца. Они часто оснащены цифровой камерой, поэтому образец можно наблюдать с помощью компьютера. Это позволяет провести глубокий анализ микроскопического изображения. Оптические микроскопы могут обеспечивать увеличение до 1250 раз с теоретическим пределом разрешения 0,250 микрометров. Тем не менее, развитие сверхразрешенной флуоресцентной микроскопии в последнее десятилетие привело оптическую микроскопию в наноразмерность.

Варианты и примеры использования оптического микроскопа:

1. Стереомикроскоп : предназначен для наблюдения образцов в 3D при небольшом увеличении.
2. Поляризационный микроскоп : используется в оптической минералогии и петрологии для выявления минералов и горных пород в тонких срезах.
3. Двухфотонный микроскоп : позволяет получать изображения живых тканей глубиной до 1 мм.
4. Инвертированный микроскоп : исследует образец снизу; обычно используется для металлографии и клеточных культур в жидкости.
5. Эпифлуоресцентный микроскоп : разработан для анализа образцов, содержащих флуорофоры.

Основные оптические микроскопы часто встречаются в классах и дома. Сложные - широко используются в фармацевтических исследованиях, микробиологии, микроэлектронике, нанофизике и минералогии.

II. Электронные микроскопы

Электронный микроскоп использует пучок ускоренных электронов для получения изображения образца. Точно так же, как оптические микроскопы используют стеклянные линзы, электронные микроскопы используют фасонные магнитные поля для создания систем электронно-оптических линз.

Современные электронные микроскопы способны увеличивать образцы до 2000000 раз, однако они все еще полагаются на прототип Руска (разработанный в 1931 году) и его связь между разрешением и длиной волны. Электронные микроскопы имеют некоторые ограничения: они дороги в изготовлении, обслуживании и должны быть размещены в стабильных средах, таких как системы подавления магнитного поля. Также объекты должны просматриваться в вакууме.

Два основных типа электронного микроскопа:

1. Просвечивающий электронный микроскоп: используется для наблюдения за тонкими образцами, через которые могут проходить электроны, создавая проекционное изображение. Он может захватывать мелкие детали размером с колонку атомов. В этом случае образец обычно представляет собой очень тонкий срез (<100 нанометров), и изображение создается в результате взаимодействия образца с электронами при прохождении пучка через образец. Современные аппаратные корректоры могут помочь этому микроскопу достичь высокого разрешения в 50 пикометров с увеличением, превышающим 50 000 000 раз.

2. Сканирующий электронный микроскоп: генерирует изображения образца путем сканирования его поверхности сфокусированным пучком электронов. Электроны взаимодействуют с атомами в образце и генерируют сигналы, которые содержат данные о составе образца и топографии поверхности. Поскольку этот тип микроскопии отображает только поверхность (не внутреннюю часть) образцов, он обеспечивает низкое разрешение изображения по сравнению с просвечивающей электронной микроскопией. Тем не менее, он может генерировать хорошее качество трехмерных изображений поверхности образца. Вещи, которые вы можете наблюдать с помощью сканирующего электронного микроскопа, включают элементы на головке булавки, волосковые клетки внутреннего уха человека и поверхность глаза мухи.

Электронные микроскопы широко используются для изучения ультраструктуры различных неорганических и биологических образцов, таких как металлы, кристаллы, образцы биопсии, крупные молекулы, клетки и микроорганизмы. Современные электронные микроскопы оснащены специальными цифровыми камерами и фрейм-грабберами для записи структуры образца и создания электронных микрофотографий. Они часто используются в промышленных целях (для помощи в процессе производства) и в криминалистике (для предоставления доказательств в преступных и юридических целях).

III. Сканирующий зондовый микроскоп

Сканирующая зондовая микроскопия была открыта в 1981 году для изображения поверхности образца на атомном уровне. Он использует физический зонд для сканирования образца и формирования сильно увеличенных изображений. Исходя из цели исследования, в сканирующей зондовой микроскопии используются разные методы. Например, прибор может быть установлен в «режим постукивания», при котором кантилевер колеблется так, что наконечник периодически касается поверхности образца. Это в основном используется для изучения образцов с мягкими поверхностями. В другом способе микроскоп может быть установлен в «режим контакта», при котором между острием кантилевера и поверхностью образца прикладывается постоянная сила. Этот режим быстро создает изображения поверхности. В отличие от методов электронной микроскопии, образцы не требуют помещения в определенную вакуумную среду. Вместо этого они могут отображаться на воздухе при комнатном давлении и температуре или внутри жидкого реакционного сосуда. Однако, они часто не полезны для анализирования жидкостных или твердотельных интерфейсов.

Сканирующие зондовые микроскопы используются в широком спектре естественных наук, включая медицину, клеточную и молекулярную биологию, физику твердого тела, химию полимеров и полупроводниковую науку и технику. Например, в молекулярной биологии этот метод микроскопии используется для анализа структуры и механических характеристик белковых комплексов и сборок. В клеточной биологии он используется для определения взаимодействия между определенными клетками и различения нормальных клеток и раковых клеток на основе твердости клеток. В физике твердого тела он используется для изучения взаимодействия между соседними атомами и изменений в расположении атомов посредством атомных манипуляций.

Шаг 2. Увеличение микроскопа

Существует минимальное увеличение, которое необходимо для оптимальной разрешающей способности микроскопа. А вот превышение пределов полезного увеличения приводит к тому, что изображение страдает от такого явления, как пустое увеличение. Поэтому, чтобы получить четкое изображение с оптимальным разрешением необходимо правильно комбинировать окуляр и объектив.

Существуют комбинации объектива и окуляра, которые лежат в диапазоне полезного увеличения.

В таблице ниже приведены различные комбинации.

Шаг 3. Техника наблюдения

Для наблюдения необходимых Вам объектов или процессов, важно также выбрать технику наблюдения. Они отличаются между собой как по технической составляющей, так и, очевидно, по получаемому изображению.

Перечислим имеющиеся техники:

Светлое поле (Bright Field)

Основана на формировании изображения под воздействием пучка света. Особенно эффективно ее методы применяются для контроля структуры изучаемых объектов, содержащих в себе либо производящие тени элементы, либо элементы, которые имеют очень резко отличающийся от своего окружения коэффициент преломления.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется для изучения непрозрачных отражающих свет объектов (окрашенные шлифы металлов или руд, биологических тканей). Особенно эффективным применение данного метода может быть для контроля полупроводниковых пластин и фотошаблонов при проектировании и производстве различных изделий функциональной электроники, так как они содержат в своем составе элементы, имеющие очень резко отличающийся от своего окружения коэффициент преломления.

Освещение объекта наблюдения производится строго сверху через объектив, являющийся в данном случае конденсором. Изображение создается за счет того, что разные участки объекта наблюдения имеют разную отражающую способность, а отраженные лучи имеют различную интенсивность.

Темное поле (Dark Field)

При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой (EPI-illuminator, EPI—microscope, EPI-objective lens).

Флуоресценция (Fluorescence)

Суть техники в том, что молекулы способны поглощать кванты света и переходить в электронно-возбужденные состояния. Возвращение молекулы в «обычное» (основное) состояние, сопровождающееся излучением света, называют флуоресценцией. Поглощение и флуоресценция обуславливаются строением энергетических уровней электронов молекулы и поэтому является специфическим, для каждого типа молекулы, свойством.

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Фазовый контраст (Phase Contrast)

При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз этих изменений заметить не может и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении невидимых фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Дифференциально-интерференционный контраст (DIC)

Данная техника широко применяется для создания контраста в неокрашенных прозрачных образцах и используется как в материаловедении, так и при проведении биологических исследований.

Она позволяет определить оптическую плотность исследуемого объекта на основе принципа интерференции и таким образом увидеть недоступные глазу детали. Относительно сложная оптическая система позволяет создать чёрно-белую картину образца на сером фоне.

Принцип данного метода состоит в том, что поляризованный луч расщепляется призмой Номарского на два луча, которые проходят через образец разными оптическими путями. Длина этих оптических путей (т. е. произведение показателя преломления и геометрической длины пути) различна. Впоследствии эти лучи интерферируют при слиянии. Это позволяет создать объемное рельефное изображение, соответствующее изменению оптической плотности образца, акцентируя линии и границы.

Шаг 4. Объективы

К выбору объектива надо отнестись очень ответственно - так как есть перечень параметров для подбора. К примеру, на сайте Nikon Healthcare https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/objectives/ есть функция подбора объектива по фильтрам, что весьма удобно. Также имеются расшифровки обозначений характеристик.

Объективы классифицируются по степени коррекции аберраций (оптических искажений) и линейному увеличению:

• План/Plan – в таких объективах исправлены сферические аберрации. Всё изображение резкое и четкое.
• Ахромат/Achromat – в этих объективах исправлены хроматические аберрации для двух длин волн (красный и синий, либо красный и зелёный), то есть волны с этими длинами волн, сфокусированы в одной точке.
• Флюор/Fluor – в таких объективах скорректированы хроматические аберрации для нескольких длин волн. Так же такие объективы пропускают намного больше света, чем Ахроматы. Применяются для исследований в УФ спектре, поскольку используются специальные стекла с пропусканием в УФ области спектра.
• Апохромат/Apochromat – в таких объективах скорректированы аберрации для четырех и более длин волн. Обеспечивают превосходную цветопередачу и яркость изображения. Пропускают больше света из ИК и видимого спектра, чем Флюорит, но меньше УФ.

Шаг 5. Моторизация

На этапе подбора микроскопа также необходимо определиться нужна ли моторизация или нет. Моторизовать микроскопы Nikon можно не все, а только исследовательского класса. Моторизовать можно столик, револьвер и фокус, кубы светофильтров, флуоресцентный осветитель. В общем, все что душе угодно.

Это удовольствие стоит прилично, но что это дает?

• Моторизированный револьвер позволяет переключать объективы простым нажатием на кнопку.
• Столик можно будет перемещать удаленно или с помощью интерфейса ПК.
• Автоматическая фокусировка, смена светофильтров по нажатию и т.п. - все это может уменьшить монотонность работы и увеличить производительность исследователя.

Шаг 6. Камера

Существуют камеры, которые вставляются в монокулярный или бинокулярный микроскоп вместо окуляра. Они называются окулярными. Если тубус тринокулярный - то такая камера вставляется в специальный третий порт для окулярной камеры.

Окулярные камеры бывают либо без оптических элементов, либо поставляются с окулярным адаптером (серии камер UCMOS, UHCCD и EXCCD). Адаптер очень часто изготовавливают съемным и не редко с резьбой C-mount, чтобы при необходимости можно было установить на камеру другой адаптер для подключения к микроскопу, у которого порт для камеры имеет уникальный разъем.

Окулярные камеры без адаптеров обычно отличаются небольшими размерами и невысокой ценой (серия камер SCMOS). Самые маленькие видеоокуляры могут быть размером со спичечный коробок. Но наряду с этими плюсами есть и довольно существенные минусы. При размещении сложной электроники в компактном корпусе часто приходится жертвовать потребительскими характеристиками, поэтому камеры передают менее качественные изображения в сравнении с крупногабартиными собратьями. Причем отсутствие оптических элементов не позволит захватить изображение с большим рабочим полем. А это будет сильно мешать, когда необходимо сохранить на компьютер или показать на мониторе максимально похожую картинку, которую пользователь видит через окуляры - видимое поле в окулярах будет больше в два-три раза. Хотя нужно отметить, что невысокая цена и приемлемое качество изображения делают этот вид камер подходящим практически для любого исследователя-любителя.

Цифровые камеры

Цифровые камеры для подключения к микроскопам - это всегда C-mount камеры. Чисто теоретически, используя правильный адаптер, к микроскопу можно подключить любую C-mount камеру. Ассортимент предлагаемых на рынке камер очень велик, и разброс цен на это чудо техники тоже. Все зависит от технических особенностей (размера/типа/производителя сенсора, интерфейса передачи данных, встроенных предобработках изображения и прочее).



В реальности для большинства световых микроскопов подойдет самые простые камеры, исключение - темнопольные и люминесцентные микроскопы, при работе с которыми нужна очень высокая чувствительность сенсора. Для этих двух типов исследований можно использовать высокочувствительные камеры.

Еще одна характеристика камеры важна при работе инструментами под микроскопом (например, паяльником под стереомикроскопом) - это скорость передачи или отображения на экране монитора передаваемых с камеры данных. При недостаточной скорости, движения инструмента на экране будут отставать от движений производимых в действительности, что напрочь может отбить желание работать глядя на монитор, а не щуриться в окуляры. При передаче качественного изображения на экран монитора узкое место - это интерфейс. У камеры USB 2.0 скорость на максимальном разрешении будет не выше 8 кадров в секунду, тогда как камера USB 3.0 показывает в семь с лишним раз большую скорость - 60 кадров в секунду.

В плане камер, на сегодняшний день Nikon занимает лидирующие позиции на рынке. Возможность съемки при высоком разрешении с большой частотой кадров, несравненное поле зрения (F.O.V.), наличие CMOS-матрицы, охладительных элементов, соответствие современным интерфейсам передачи данных, совместная работа с программным обеспечением - делают данный исследовательский инструмент одним из лучших, если не лучшим на рынке.

Шаг 7. Программное обеспечение

Программное обеспечение – это всегда как вишенка на торте в любой конфигурации.

Что предлагает нам программное обеспечение Nikon.

Nikon предполагает, что все наши клиенты смогут создавать и использовать каждый компонент системы с максимальной производительностью а именно:

• иметь возможность снимать;
• делать сценические движения;
• захватывать Z и оставаться в фокусе, не прерывая жизненные события, которые вы хотите исследовать и изучать.

NIS-Elements обеспечивает один и тот же интерфейс, управление, рабочий процесс и терминологию, независимо от того, используется ли она для широкоформатного, конфокального или сверхразрешающего изображения.

С NIS-Elements вы можете со временем расширять свою систему (например, модернизировать детектор, добавлять дополнительные детекторы, менять источники света, добавлять конфокальные, добавлять высокопроизводительные функции и т. д.).

NIS-Elements Advanced Research

Оптимизированный для передовых исследовательских приложений, флагманский программный пакет Nikon включает полностью автоматизированное получение изображений, расширенное управление устройствами и мощные инструменты анализа и визуализации.

Фундаментальные исследования NIS-Elements (Basic Research)

Разработанный для стандартных исследовательских приложений, таких как анализ и фотодокументирование флуоресцентных изображений, NIS-Elements BR обладает возможностью четырехмерного сбора данных и расширенными возможностями управления устройствами.

NIS-Elements D

Пакет программ для фотодокументации и клинических применений. Включает в себя основные инструменты измерения и отчетности.

NIS-Elements конфокальные (Confocal)

Пакет программного обеспечения, включающий в себя конфокальные элементы управления определенными данными и расширенные функции анализа и визуализации изображений.

NIS-Elements HC

Полное решение для сбора данных для анализа для приложений с высоким содержанием изображений. Бесперебойный рабочий процесс от микроскопа и периферийных устройств до анализа и управления данными.

---

У нас Вы можете заказать или купить микроскопы в Беларуси!

Если после прочтения данного материала у Вас остались вопросы:

Коммерческое предложение и консультация:
Сосновец Владислав
+375 29 589 73 02 Viber, Telegram, WhatsApp)


Специалист по микроскопии Nikon в РБ
ЗАО "Аванта и К" - официальный дистрибьютор микроскопов Nikon в Беларуси